Thin Layer Chromatography (TLC/KLT)

Thin Layer Chromatography (TLC/KLT)

Topic Progress:

KLT atau kromatografi lapis tipis adalah salah satu materi praktikkum yang hampir selalu keluar di OSN. Tidak hanya OSN, tiap tes komprehensif praktikkum di Pelatnas juga selalu mengeluarkan KLT, biasanya ditemani sintesis senyawa organik. Pada topik ini, akan dikupas banyak hal yang dapat meningkatkan performa kita dalam melakukan KLT. Dasar textbook yang digunakan di topik ini adalah Laboratory Techniques in Organic Chemistry karya Mohrig, Alberg, Hofmeister, dan Schatz.

Pertama, mengapa teknik ini dinamakan kromatografi? Dulunya, semua metode yang berjulukan “kromatografi” digunakan untuk memisahkan warna, misalnya di salah satu praktikkum Pelatnas I IChO 2019, ada praktikkum pemisahan warna permen coklat M&M’s dengan kromatografi kolom. Sekarang ini, istilah kromatografi lebih merujuk ke pemisahan campuran senyawa. Teknik analisis kromatografi sendiri ada banyak sekali, ada kromatografi dengan kolom, kromatografi kertas, kromatografi gas (GC), kromatografi cair (LC), HPLC, dan seterusnya.

Dalam metode kromatografi, kita mengenal istilah fasa gerak dan fasa diam. Di KLT sendiri, fasa gerak yaitu developing solvent, sementara fasa diamnya yaitu adsorbent di platnya itu sendiri. Pergerakan zat yang dianalisis bergantung pada kepolaran zat itu sendiri dan developing solventnya.

Alat dan Bahan

Alat dan bahan melakukan KLT relatif sangat mudah dan sederhana. Kita akan diberikan plat dari silica gel yang berperan sebagai fasa diam, pipa kapiler, pelarut volatile, sampel dan standar, pelarut yang berperan sebagai fasa gerak, developing chamber yang biasanya diganti oleh beaker glass, dan kertas saring untuk menjenuhkan chamber.

Prosedur Melakukan KLT

KLT adalah salah satu metode yang simpel, mudah, dan yang paling penting adalah murah. Itulah mengapa selalu ada praktikkum ini di perlombaan besar seperti OSN. Untuk KLT, hanya dibutuhkan sampel yang sedikit, pelarut, pipa kapiler, plat KLT, Chamber (yang kadang bisa diganti dengan beaker glass), kertas (saring), dan developing solvent. Berikut ini kira-kira gambar eksperimen KLT:

Gambar 1: Alat dan Bahan KLT (Sumber: Mohrig)

Preparasi

Biasanya, soal-soal eksperimen yang berhubungan dengan KLT memiliki prosedur yang semuanya hampir sama. Pertama, kita diminta melarutkan sampel yang berupa padatan ke pelarut yang sesuai. Pada tahap ini, kita sudah harus memiliki bayangan yang jelas akan proses dan hasil KLT yang diharapkan.

Kita harus mengetahui bahwa untuk melakukan KLT, sampel yang kita gunakan haruslah padatan dan pelarut yang digunakan haruslah volatile atau mudah menguap. Ada beberapa alasan kita harus menggunakan pelarut volatile. Pertama, kita akan menggunakan lampu UV untuk melihat spot sampel yang kita lakukan KLT, sedangkan kehadiran pelarut non-volatile dapat membuat spot ini sulit untuk divisualisasi. Kedua, apabila pelarut yang kita gunakan berdifusi, akan mengakibatkan noda yang ingin kita lihat melebar dan mempengaruhi hasil visualisasi. Hal ini pernah terjadi di praktikkum OSN 2017 dan 2018, di mana peserta diminta menggunakan pelarut non-volatile untuk KLT dan hasil KLT para peserta memiliki noda yang sangat lebar.

Untuk melakukan KLT yang baik, kita perlu memberi tanda yang di plat KLT supaya kita dapat mengetahui titik awal dan titik akhir pergerakan sampel di plat. Salah satu caranya adalah dengan menambahkan garis di plat KLT menggunakan pensil batangan (jangan pensil mekanik!) yang soft (seri B, jangan gunakan seri H!) kira-kira 0.5 – 1 cm dari bawah plat dan dari atas (lihat gambar untuk referensi). Kita akan menghentikan proses KLT ketika fasa gerak telah mencapai tanda batas yang kita tentukan.

Dengan pipa kapiler, totolkan zat yang sudah dilarutkan ke garis di bawah plat yang telah dibuat. Sebelum menotolkan untuk kedua kali dan seterusnya, tunggu agar pelarut yang ditotolkan menguap terlebih dahulu. Untuk pelarut volatile, proses ini berjalan dengan sangat cepat, namun tidak dengan pelarut non-volatile seperti air. Totolkan secukupnya saja, mengikuti prosedur yang sudah disediakan (umumnya 3 – 5 kali penotolan). Apabila kita menotolkan zat terlalu banyak, akan terjadi fenomena bernama tailing (spot berekor seperti komet). Usahakan juga agar hasil penotolan tidak melebar (sekecil-kecilnya), karena penotolan yang melebar mengakibatkan spot yang diamati juga melebar.

Gambar 2. Hasil KLT yang diharapkan (Sumber: Wikipedia)

Melakukan KLT

Siapkan chamber (atau beaker glass) dan masukkan kertas saring, kemudian tambahkan developing solvent. Kocok (memutar!) agar solvent segera naik ke kertas saring sehingga uap dalam chamber akan menjadi jenuh. Masukkan plat KLT menggunakan pinset (jangan dengan tangan kosong agar plat tidak rusak) dengan posisi sedikit miring (idealnya lebih dari 10 namun kurang dari 30 derajat). Hati-hati karena pada tahap ini banyak siswa yang menjatuhkan platnya sehingga terendam dan eksperimen gagal.

Amati hingga solventnya naik ke batas atas yang tadi sudah ditandai menggunakan pensil. Setelah solventnya sampai di batas atas, ambil platnya dengan pinset, kemudian keringkan dengan cara diangin-anginkan. Umumnya, kita akan diminta menggunakan lampu uv untuk melihat bercak sampel yang diamati di atas plat. Tandailah spot yang diamati dengan pensil. Apabila spot yang diamati besar dan melebar, carilah titik tengah dari antara spot yang intensitasnya paling kuat.

Menghitung Faktor Retensi

Hal selanjutnya yang perlu dilakukan para peserta adalah menghitung faktor retensi, $R_f$. Setelah menghitung faktor retensi, kita dapat membandingkan sampel yang kita miliki dengan standar yang tersedia.

$R_f = \frac{jarak yang ditempuh sampel}{jarak yang ditempuh developing solvent}$

Perlu diingat, nilai $R_f$ bergantung pada developing solvent yang digunakan. Nilai $R_f$ yang kita peroleh belum tentu sama dengan yang diperoleh di literatur, apabila solvent yang digunakan berbeda komposisinya atau senyawanya.

Tanya – Jawab Seputar KLT

Apa bahan penyusun plat KLT?

Plat KLT ada banyak jenis, namun yang digunakan di OSN, Pelatnas, dan IChO memiliki bahan dasar yaitu Silica Gel. Plat dengan bahan ini sifatnya polar. Oleh karena itu, semakin polar zat yang dianalisis, semakin sulit sampel yang digunakan untuk menaiki plat kecuali fasa gerak yang digunakan (developing solvent) juga polar (campuran air dan asam asetat, misalnya).

Bagaimana prosedur menotolkan dengan pipa kapiler yang baik?

Celupkan pipa kapiler ke dalam larutan sampel yang akan diuji. Tutup pipa kapiler dengan tangan agar larutan terperangkap dalam pipa. Totolkan larutan sampel secara vertikal (tegak lurus) terhadap plat KLT. Lakukan dengan lembut dan hati-hati agar plat tidak tergores atau rusak.

Apa fungsi penambahan kertas saring? Seberapa besar ukurannya?

Developing solvent yang digunakan dalam analisis KLT biasanya mudah menguap. Kertas saring ditambahkan agar tekanan uap solvent dalam chamber jenuh, sehingga saat melakukan KLT solvent yang sudah berada di plat tidak kembali menguap. Ukuran kertas saring yang digunakan biasanya adalah sekitar $2/3$ atau $3/4$ tinggi plat KLT. Pada perlombaan dan pelatnas, kertas saring biasanya sudah dipotong dengan ukuran yang sesuai sehingga bisa langsung digunakan.

Mengapa saya tidak boleh menggunakan pensil mekanik atau pensil H?

Pensil mekanik atau pensil hard bisa menggores plat KLT. Selain itu, terdapat bahan tambahan seperti senyawa-senyawa timbal pada pensil mekanik yang dapat mempengaruhi spot.

Prosedur KLT saya menyuruh saya untuk melarutkan sampel tanpa ketentuan khusus. Bagaimana standar melarutkan yang benar, supaya spot saya jelas terlihat namun tidak terjadi tailing?

Tidak ada standar yang pas untuk semua senyawa. Seberapa banyak zat yang dibutuhkan juga bergantung pada $M_r$ zat tersebut. Namun, kita bisa menggunakan perkiraan yaitu zat seujung spatula dilarutkan dalam 1 mL pelarut.

Prosedur KLT saya menyuruh saya untuk menentukan sendiri developing solvent yang harus saya gunakan. Bagaimana pedoman yang baik untuk pembuatan developing solvent?

Apabila anda menemukan soal eksperimen dengan prosedur seperti ini, saya ucapkan selamat! Anda telah lolos ke Pelatnas tahap III IChO. Developing solvent yang baik adalah campuran yang kira-kira memiliki polaritas sesuai dengan sampel yang akan diujikan. Misal, apabila senyawa yang kita uji sangat polar (misal: asam askorbat) dan developing solvent yang digunakan non-polar (misal: kloroform), maka sampel tidak akan naik melainkan akan tetap berada di dasar plat.

Berapakah nilai $R_f$ yang dapat dikategorikan baik?

Nilai $R_f$ untuk eksperimen yang baik biasanya berada di rentang 0.30 – 0.70. Namun, ini tidak bisa dijadikan patokan karena bergantung juga ke pembuat soal eksperimen itu sendiri.